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| 過氧化物酶和過氧化物酶結合物化學發光檢測 | |||
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物Lumigen PS-阿托TMA-6是新的過氧化物酶和過氧化物酶結合物化學發光檢測試劑。每個這些試劑的試劑溶液制備按將兩種水溶液以1:1的比例相結合，并包含專有的基板，過氧化氫 ??，和增強子在緩沖溶液。的過氧化物酶與試劑的反應非常迅速產生的峰值光強度。與目前使用的基于魯米諾試劑，這些積累基本上沒有涉及排放峰值時間。
高原強度的發展，在實驗中，光測量的精確定時是不必要的，用于確定光強度對酶量的依賴性。光的強度是足夠的，使檢測10-20摩爾的HRP在6分鐘的測定與PS-阿托和10-19摩爾TMA-6的兩倍以上使用極限的檢測標準的信號的空白空白的標準偏差（見表I）。日志日志積光強度與HRP在實驗范圍內10-16-10-20摩爾摩爾展出了高線性度。據預計，分析精度和動態范圍將得到改善，從更大數量的復制具有更寬的動態范圍的測量儀器上的數據加以收集。
圖9所示。圖像比較西方涂抹新鮮制備β-半乳糖苷酶檢測化學發光TMA-6工作解決方案（一）及（b）于4℃保存1年 他們兩個有9分鐘的孵育膜在TMA-6和5秒的曝光后得到。（A = 5000，B = 1000 PG PG，C = 180皮克，D = 30 PG，和E = 5 PG） （點擊放大）。
雖然與TMA-6溶液中測定的過氧化物酶的檢測提供了幾乎相當于實現了與PS-阿托的靈敏度和工作范圍，更高的絕對光強度與PS-阿托對于一個給定的酶量有所放大的非特異性結合的影響印跡膜。這可以有效果，在某些情況下限制印跡檢測的靈敏度。此外，TMA-6所產生的光的強度較低，允許使用較高的底物濃度在工作試劑。這反過來，最大限度地減少擴展孵化或暴露在高層次的結合酶底物耗盡。
膜基印跡檢測的檢測試劑可靠的比較是非常困難的。如在下面更詳細討論的，印跡膜，特別是由X射線膠片上的光密度，定量測量是不精確的。推斷的檢測試劑的影響獨自從這種類型的測量需要謹慎。另一個困難是抗體數量和靈敏度明顯的阻塞條件的影響。這些參數必須在印跡法憑經驗優化。哪些參數是最優的出現依賴于檢測試劑的選擇，以及蛋白質分析物和其他因素。任何打算檢測試劑進行比較，然后，面對所有分析變量標準化，在這種情況下，一些測試將在非最佳條件下進行，否則使用單獨優化的條件下進行技術上的不平等比較與選擇。
銘記這些注意事項，TMA-6，成立于ECL提前Amersham Biosciences公司Western印跡檢測試劑盒，已經比7兩個基于魯米諾試劑和試劑含有9,10 -二氫吖啶PS-3 Western blot檢測系統的性能。TMA-6檢測試劑所示，可提供優越的背景信號，并檢測蛋白水平的降低比其他材料。每個試劑單獨優化的實驗條件下使用。
過氧化物酶和結合物的高靈敏度地檢測的化學發光試劑的市售了好幾年。在使用中的大多數試劑構成增強魯米諾的檢測系統。例子包括Amersham公司的ECL，從皮爾斯生物技術公司（Rockford，伊利諾州）超級信號，Lumiglo從嘉里建設有限公司（馬里蘭州蓋瑟斯堡），以及羅氏和鄰臨床診斷試劑。物Lumigen PS-1，唯一先前nonluminol的過氧化物酶檢測試劑使用的9,10 -二氫吖啶酯化合物作為過氧化物酶底物。所有這些試劑都由其制造商提供的，作為兩個獨立的部件，必須在即將使用前進行組合，以創造一個有效的解決方案。這兩個工作溶液中過早反應的底物與過氧化氫 ??的混合試劑中的底物的水解不穩定性的問題，防止長期貯存溶液。
一些商業化學發光過氧化物酶底物的工作方案規定的有用壽命進行了調查。他們發現范圍從“幾個小時”24小時在室溫下。更穩定的工作試劑解決方案提供了簡化的自動化分析的優勢。
對PS-阿托和TMA-6基板的設計的早期發現，的化學發光AP襯底物Lumigen APS-5也經歷了化學發光的過氧化物酶與過氧化氫 ??的催化反應（參見圖10）。反應的APS-5與提示這兩種酶產生強烈的化學發光。環外雙鍵化合物與更大的水解穩定性一個硫基結果，在更換的磷酸基團。
在這種結構類超過50種不同的候選化合物已準備和測試。選擇兩種化合物用于商業開發解決方案的分析和固相分析TMA-6，PS-阿托，在結構上非常相似，但有微妙的不同性能。令人滿意的水溶性的烷基磺酸取代基，每個分子中內置憑借保留。朝向過氧化物酶的酶促活性被保留，為的是達到最大光強度的速度，。得顯著，未觀察到過氧化氫在襯底中的乙烯基硫醚基團的非酶自氧化，即使在最后的工作溶液。
PS-阿托和TMA-6，評估通過監視它們的任何變化后的存儲期間的化學發光峰值強度，工作溶液的試劑的穩定性明顯優于其它試劑在使用。只要為3個??星期，兩個試劑的工作溶液，在室溫下穩定。解決方案可以在4℃下儲存，??并使用幾個月，如在圖7中示出。結果控制通過比較新鮮配制的工作液。含過氧化物酶底物的組分溶液表現出甚至更長的貯存穩定性。沒有可檢測到5個月后，在40℃或1年??，在室溫下在溶液中測定的性能退化的發生。這種程度的水解穩定性遠遠超過所有其他商業的化學發光過氧化物基板。
用于可視化固定化的酶標記抗體的化學發光檢測試劑不一定必須符合相同的嚴格標準的貯存穩定性，例如，試劑在船上使用一個自動免疫分析儀必須。由于精度分析很少印跡技術正式評估，測量往往是最好看作是半定量。按鍵實驗變量是很難控制的抗體的質量，膜性能，阻塞協議和綁定協議。此外，X射線膠片圖??像的光密度分析不能檢測在二維光強度圖案的細微的差別。（現代CCD相機成像系統，但是，改進的能力有些印跡分析。）
由于這些原因的檢測試劑的質量隨著時間的推移，微小的變化不會導致可測量的衰減印跡檢測性能。TMA-6存儲的質量的評估工作溶液中的官能印跡測定形式，在結果沒有差異，得到即使在溶液中，使用可以在更嚴格的，儀器為基礎的解決方案測定中看出一些性能劣化。TMA-6存儲長達一年的工作方案，在4°C，使用前涂抹檢測的蛋白質，從而是可以接受的做法。
結論PS-阿托是第一化學發光的過氧化物酶底物，提供了能夠被存儲為一個瓶使用的試劑。在4℃下穩定性的測試沒有發現存儲的工作溶液，在室溫下或4個月?3周的試劑的性能惡化 此外，過氧化物酶底物本身是穩定的，在室溫下了數個月。工作溶液的擴展的貯存穩定性允許一個單一的容器內的試劑，可以采用過氧化物酶的化學發光檢測。除了這種方便的明顯的好處，PS-阿托可以使用，而不需要額外的泵送和混合裝置將自動分析儀器。它能夠允許的極端敏感性過氧化物酶檢測定量過氧化物濃度超過四個日志，檢出限10 zmol在6分鐘檢測在保守估計。
TMA-6，印跡應用中使用，如Western印跡法，開??發股份PS-阿托在快速信號的產生和試劑的穩定性方面的優點。它允許基于膜的印跡檢測的高靈敏度檢測。成像參數的優化，以提供足夠的時間，信號的持續時間被延長的典型的印跡膜。
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哈希姆，博士，AKHAVAN Tafti的是副總裁兼首席科學官，謝文化，哲學博士，和雷努卡DeSilva酒店，博士，研究的科學家威廉·G·克里普斯和羅伯特A. Eickholt是研究化學家理查德·漢德利博士，主任知識產權朗達·林斯基和邁克爾·Mazelis是研究化學家A.保羅Schaap博士，物Lumigen公司（密西根州Southfield）的總裁。
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