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| 影響中空纖維生物反應(yīng)器抗體生產(chǎn)效率的因素 | |||
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10000他的生產(chǎn)效率-并使用左旋公司，Acusyst小和Unisyn科技公司30,000兆瓦截止中空纖維生物反應(yīng)器盒，CP2000的生物反應(yīng)器系統(tǒng)進行了研究。兩個墨盒的類型產(chǎn)生顯著數(shù)量的小鼠單克隆抗體，但生產(chǎn)效率（毫克抗體每升培養(yǎng)基中消耗的制造）更高的30000兆瓦墨盒。此外，較小的孔徑盒抗體生產(chǎn)和26至33天與11?20天為30,000兆瓦盒細胞生長所顯示的延長滯后期。高內(nèi)毛細管介質(zhì)的進料速率（5.0升/天為30,000 MW和8.4升/天為10,000 MW）可能會降低整體抗體的生產(chǎn)效率，并降低進料速率（3.5和7.2升/天，分別）可能每升產(chǎn)生更多的抗體介質(zhì)消耗。
從匯合的生物反應(yīng)器濾芯的定期除去過量的細胞可以增加抗體的產(chǎn)生和擴展的游程的長度。抗體的批量收獲可能會導(dǎo)致更多的高濃縮抗體比連續(xù)收獲。
使用中空纖維筒作為基質(zhì)用于雜交瘤細胞生長的生物反應(yīng)器系統(tǒng)的生產(chǎn)單克隆抗體的multigram量的有效方法。13的空心纖維筒可產(chǎn)生從污染的細胞或血清蛋白的高度濃縮的單克隆抗體相對自由。4這些墨盒，可主要在10,000（如腎透析盒）分子量孔徑或只在生物反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)的大孔徑的配置。
使用左旋公司（明尼阿波利斯），Acusyst小和Unisyn Technologies公司（加利福尼亞州Tustin），CP2000生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，我們調(diào)查了幾種類型的中空纖維筒的維持小鼠雜交瘤細胞的生長的能力和，以產(chǎn)生抗體。我們還研究了幾個關(guān)鍵的運行參數(shù)，包括中等進給率，抗體收獲方法，細胞去除，和葡萄糖利用率（GUR）對抗體產(chǎn)生的影響。
材料和方法
細胞系。鼠雜交瘤VA1 18D7.3.2.4（antivalproic酸）（IgG1的），鐵道部9B1（antimorphine）（IgG1的），METH7-4B6（IGA）（antimethamphetamine），和PCP1.9D10（IgG1的）（antiphencyclidine）生長在Iscove氏改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基（IMDM）（敏達公司，赫恩登，VA），補充有2mM L-谷氨酰胺（Gibco公司，格蘭德島，NY）和10％胎牛血清（FBS）（Hyclone公司實驗室，洛根，猶他州） 。采用國家統(tǒng)計局融合伙伴生成所有的雜交瘤。
基線靜態(tài)培養(yǎng)生產(chǎn)率對于每種細胞系，建立了5×10重復(fù)播種4個細胞/在生長培養(yǎng)基（如上所述），在標(biāo)準(zhǔn)的T25燒瓶毫升（康寧，康寧，紐約州）。將培養(yǎng)瓶置于37℃，7％CO 2 72小時，然后除去培養(yǎng)基，并以1000rpm離心10分鐘。得到的上清液中測定總的和特異性免疫球蛋白通過ELISA（表I），如于下文中描述的“抗體濃度的測定。” （表尚未公布上線。）
生物反應(yīng)器系統(tǒng)和中空纖維筒。的Acusyst Jr。被用Acucell 1100（左旋，Inc。）的10,000兆瓦墨盒表面面積的19呎和120毫升毛細管外空間（ECS）（表一）中運行。墨盒采用了逆流循環(huán)過程，以積極地輸送介質(zhì)來回的內(nèi)毛細管（ICS）和ECS之間。該系統(tǒng)是獨特的Acusyst Jr。和其cultureware并且是不可用于測試的其他墨盒或系統(tǒng)。
CP2000的比較采用其他兩種10,000兆瓦墨盒：本Clirans T220銅氨纖維腎透析盒（19平方英尺的面積，100毫升ECS）（Terumo Corp。制造，新澤西州Somerset）和BR2010兩性共聚物膜墨盒（35平方英尺的面積，210毫升ECS）（Unisyn技術(shù)公司，加利福尼亞州Tustin）。這些也較BR3530醋酸纖維素30000兆瓦的生物反應(yīng)器，從Unisyn技術(shù)暗盒公司（表I）。
一般生物反應(yīng)器的運行參數(shù)。的小鼠雜交瘤培養(yǎng)物中的IMDM制劑。在對數(shù)生長期（> 85％存活通過臺盼藍排除法）離心細胞，在400×g離心5分鐘，然后在新鮮的生長培養(yǎng)基中重懸。約10 9則細胞被引入到每一個生物反應(yīng)器筒的精英由一個大的注射器。
中空纖維生物反應(yīng)器中進行了墨盒的兩個生物反應(yīng)器系統(tǒng)與如上所述的IMDM測試。FBS的濃度在ICS介質(zhì)的所有生物反應(yīng)器實驗中，除了那些使用鐵道部9B1和PCP1.9D10分別為3％，第20公升的媒體和1％，為余下的實驗。在ICS中的MOR 9B1和PCP1.9D10運行的FBS濃度為3％在整個實驗過程中。血清濃度為MOR 9B1和PCP1.9D10實驗貫穿保??持在10％以上。對ECS的FBS濃度為其他細胞系中逐漸從10到1％通過引入ICS料培養(yǎng)基整個實驗過程中降低。
每個生物反應(yīng)器運行的運行參數(shù)進行操縱，以最大限度地提高生產(chǎn)力。他們根據(jù)細胞系，生物反應(yīng)器系統(tǒng)，以及生物反應(yīng)器中盒的要求而變化。最初的毛細血管內(nèi)再循環(huán)率對于每個CP2000運行的范圍350和550毫升/分鐘之間，并逐漸增加至999毫升/分鐘的最大設(shè)定值。該Acusyst小的再循環(huán)率為200至400毫升/分鐘。它不能用，因為泵系統(tǒng)限制的再循環(huán)率> 400 ml / min的運行。溫度自動地由這兩個系統(tǒng)，在37±0.5℃下維持 在100％空氣和二氧化碳的流速分別保持在約100和510厘米3 /分鐘，分別貫穿每個CP2000運行的過程。pH值對運行6.9和7.3之間不等。
的葡萄糖利用率的測定。的GUR是細胞代謝和細胞生長的指示劑。5的墨盒，以維持細胞的生長的相對能力，通過測定葡萄糖的量由所用的細胞在ICS評估。在循環(huán)生物反應(yīng)器的ICS培養(yǎng)基葡萄糖濃度用羅氏血糖試劑與羅氏校準(zhǔn)的血清對COBAS生物儀器（全部來自羅氏診斷系統(tǒng)公司，薩默維爾，新澤西州）確定。
具有低古爾生物反應(yīng)器可能有太少代謝活躍的細胞表現(xiàn)出足夠的抗體產(chǎn)生。高GUR可以導(dǎo)致劇烈的過度生長和過早衰老。我們，因此，建立一個目標(biāo)GUR為不同的生物反應(yīng)器配置。在目標(biāo)GUR，運行參數(shù)，如介質(zhì)的進給率和再循環(huán)率進行了優(yōu)化，以最大限度地提高抗體的產(chǎn)生。目標(biāo)GUR是通過在不同介質(zhì)中的進給速率增長的每一個細胞系實驗來確定的，它依賴于細胞系和墨盒。250毫克/小時的目標(biāo)GUR每個生物反應(yīng)器體系的建立。
的GUR（表示為mg /小時），通過下式確定：
GUR = {進給速度（毫升/小時）×[葡萄糖（毫克/升）葡萄糖滿分（毫克/升）]} / 1000
其中葡萄糖在葡萄糖是在進入生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的補料培養(yǎng)基的濃度，和葡萄糖，滿分為葡萄糖的再循環(huán)介質(zhì)中的濃度。
抗體濃度的測定。分泌抗體的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的濃度用ELISA測定。九十六個孔 ??微量滴定板（Costar公司，劍橋，MA），預(yù)先涂有drugbovine血清白蛋白（BSA）的結(jié)合物被封鎖以防止與在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）/疊氮化物1％BSA的非特異性結(jié)合。培養(yǎng)上清的系列稀釋液從生物反應(yīng)器ECS繪制被應(yīng)用到特定的板，并通過將已知濃度的純化抗體在上板平行孔中產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量測定。
將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的孵育后，未結(jié)合的抗體除去洗滌該板在PBS /吐溫20（Sigma公司生物化學(xué)試劑，圣路易斯）。結(jié)合的抗體，通過加入堿的檢測phosphataselabeled抗鼠抗體（Zymed公司，舊金山）。抗體的濃度在405nm處有一個CR340板讀數(shù)器（SLT公司，奧地利薩爾茨堡）用分光光度計測量，并使用ELISA 3.0版計算機軟件（Meddata公司，紐約市）進行數(shù)據(jù)分析。
標(biāo)準(zhǔn)細胞生長和抗體產(chǎn)生，抗體的產(chǎn)生和細胞生長的Clirans T220，BR2010，以及Acucell 1100中空纖維筒的比率進行了比較，那些Unisyn BR3530墨盒。為了保持一致性，分別用于運行之間的比較武斷的標(biāo)準(zhǔn)。一個準(zhǔn)則是達到250毫克/小時的目標(biāo)GUR水平所需的天數(shù);另一個是需要產(chǎn)生1克抗體的天數(shù)。這些標(biāo)準(zhǔn)定義的滯后期在不同墨盒或不同的細胞系或一個給定的墨盒條件下生長的相同細胞系的比較。
孔徑對抗體產(chǎn)生的影響通過抗體的產(chǎn)生量（單位為毫克）的測定每升ICS的測定飼料介質(zhì)消耗過一段時間（生產(chǎn)效率）。由于運行在不同時間，40天是任意選擇的是代表每次運行。最后一個標(biāo)準(zhǔn)是由運行40天產(chǎn)生（克）總的抗體。
使用VA1 18D7細胞系，我們比較了抗體的產(chǎn)生和細胞生長中使用Clirans T220（泰爾茂株式會社制造，薩默塞特，新澤西州）中，BR3530，并且BR2010（Unisyn Technologies公司）的生物反應(yīng)器的CP2000生物反應(yīng)器系統(tǒng)的速率墨盒。在MOR 9B1細胞系用于將Acusyst小的生物反應(yīng)器系統(tǒng)和Acucell 1100墨盒抗體產(chǎn)生和細胞生長中的CP2000生物反應(yīng)器系統(tǒng)使用BR3530盒（表I）的比率進行比較。
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